DNA 抽出

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DNA 抽出 ( 英語 : DNA extraction )은 1869年에 프리드리히 미셔 에 依해 開發되었다. [1] 現在 DNA 抽出은 分子生物學 이나 法醫學 에서 자주 使用되는 技法이다. 化學的 方法의 境遇 抽出에 使用되는 다양한 키트가 있으며 本人의 目的에 맞는 올바른 키트를 選擇해야 抽出 節次에 所要되는 時間을 節約할 수 있다. PCR 敏感度 檢出은 常用 키트 間의 偏差를 나타내는 것으로 看做된다. [2]

基本 節次 [ 編輯 ]

基本 節次는 다음과 같다.

  1. 硏究할 細胞를 蒐集해야 한다. 이때 蒐集의 量은 使用하는 方法에 따라 다르다.
  2. 細胞膜 을 부수면 內部의 細胞質과 함께 DNA가 露出된다(세포 溶解).
  3. 이 溶液을 濃縮된 鹽 溶液(食鹽水)으로 處理하여 부서진 蛋白質, 地質 및 RNA와 같은 破片을 함께 덩어리로 만든다.
  4. 덩어리진 細胞 破片을 DNA에서 分離하기 위해 溶液을 圓心 分離한다.
  5. 細胞 溶解 段階에서 使用되는 稅制, 蛋白質, 念 및 試藥으로부터 DNA를 精製한다. 이때 가장 一般的으로 使用되는 節次는 다음 3가지이다.
    • 一般的으로 0°C에 가까운 에탄올 또는 이소프로판올 에 依한 에탄올 沈澱. DNA는 이러한 알코올에 녹지 않기 때문에 함께 凝集되어 遠心分離 時 펠릿을 生成한다. 一般的으로 아세트산 나트륨 을 添加하여 이온 强度를 증가시켜 DNA의 沈澱을 改善한다.
    • 페놀로 하여금 試料의 蛋白質을 變成 시키게 하는 페놀 -클로로포름 抽出. 샘플을 遠心分離한 後 變成된 蛋白質은 劉基相에 머무르고 核酸 을 含有한 受賞은 클로로포름 과 混合되어 溶液에서 페놀 殘留物을 除去한다.
    • 버퍼의 pH 및 廉 濃度에 따라 核酸 이 固體賞(실리카 또는 其他)에 結合( 吸着 )할 수 있다는 事實에 依存하는 미니컬럼 精製.

DNA에 結合된 細胞 및 히스톤 蛋白質은 프로테아제 를 添加하거나, 나트륨 또는 암모늄 아세테이트로 蛋白質을 沈澱시키거나, DNA 沈澱 前에 페놀-클로로포름 混合物로 抽出하는 方法 等으로 除去할 수 있다.

分離 後, DNA는 一般的으로 TE 緩衝溶液 또는 超純粹에 있는 약알칼리성 緩衝溶液에 溶解된다.

方法 選擇 [ 編輯 ]

가장 一般的인 DNA 抽出 方法에는 有機 抽出, Chelex 抽出 및 固體賞 抽出이 있다. [3] 이러한 方法 모두 分離된 DNA를 算出하지만, 産出되는 DNA의 品質, 孃 等은 全部 다르다. 그래서 DNA 抽出 方法을 選擇할 때는 費用, 時間, 安全性, 汚染 危險 等 여러 要素를 考慮해야 한다.

多樣한 生物學的 샘플에 對해 商業的으로 利用 可能한 DNA 抽出 키트가 있다.

遺棄 抽出 [ 編輯 ]

遺棄 抽出에는 여러 다른 化學 溶液을 追加하고 培養하는 것이 包含된다. [3] 溶解 段階, 페놀 클로로포름 抽出, 에탄올 沈澱 및 洗滌 段階를 包含한다. 遺棄 抽出은 값이 싸고 純粹한 DNA를 大量으로 生成하기 때문에 實驗室에서 자주 使用된다. 쉽지만 여러 段階가 必要하고 다른 方法보다 時間이 오래 걸린다. 또한 毒性 化學物質인 페놀 과 클로로포름 의 바람직하지 않은 使用과 關聯이 있으며 여러 튜브 사이에 DNA를 傳達하여 汚染 危險이 增加한다. [4] DNA의 有機的 抽出을 基盤으로 하는 여러 프로토콜이 數十 年 前에 效果的으로 開發되었지만 [5] 이러한 프로토콜의 改善되고 實用的인 버전도 지난 몇 年 동안 開發 및 出版되었다. [6]

Chelex 抽出 [ 編輯 ]

Chelex 抽出 方法은 Chelex 水枝를 試料에 添加하고 溶液을 끓인 다음 渦動 및 遠心分離하는 것이다. 細胞 物質은 Chelex 구슬에 結合하는 反面 DNA는 上等額 에서 使用할 수 있다. [4] Chelex 方法은 遺棄 抽出보다 훨씬 빠르고 簡單하며 하나의 튜브만 必要하므로 DNA 汚染 危險이 줄어든다. 그러나 Chelex 抽出度 短點이 있다. 많은 量을 産出하지 못하며, 産出된 DNA는 單一 가닥이므로 RFLP 가 아닌 PCR 基盤 分析에만 使用할 수 있다. [4]

固體相 抽出 [ 編輯 ]

스핀 컬럼 基盤 抽出 方法을 使用하는 것과 같은 固體賞 抽出은 DNA가 실리카 에 結合한다는 事實을 利用한다. DNA를 包含하는 샘플은 실리카 겔 또는 실리카 비드 및 카오트로픽 鹽을 包含하는 컬럼에 追加된다. 카오트로픽 念은 가닥 사이의 水素 結合을 妨害하고 核酸을 疏水性으로 만들어 DNA와 실리카의 結合을 促進한다. 이것은 燐酸鹽 殘留物을 露出시켜 吸着에 使用할 수 있다. [7] DNA는 실리카에 結合하고 나머지 溶液은 에탄올을 使用하여 씻어내어 카오트로픽 念 및 其他 不必要한 構成 要素를 除去한다. [3] 그런 다음 DNA는 低鹽 水溶液으로 再修化되어 비드에서 DNA가 湧出 될 수 있다.

이 方法은 PCR 및 RFLP 分析 모두에 使用할 수 있는 高品質의 大部分 이中 가닥 DNA를 生成한다. 이 節次는 自動化할 수 있으며 [4] 페놀-클로로포름 方法 보다 낮지만 處理量이 높다. 이것은 1段階 方法이다. 卽, 全體 節次가 하나의 튜브에서 完了된다. 이것은 汚染 危險을 낮추어 DNA의 法醫學 抽出에 매우 有用하다. 여러 固體相 抽出 常用 키트는 여러 會社에서 製造 및 販賣한다. 唯一한 問題는 遺棄 抽出 또는 Chelex 抽出보다 費用이 많이 든다는 것이다.

特需 類型 [ 編輯 ]

一部 샘플에서 DNA를 分離하려면 特定 技術을 選擇해야 한다. 複雜한 DNA 分離가 있는 一般的인 샘플은 다음과 같다.

  • 部分的으로 分解된 DNA를 包含하는 考古學 샘플. [8]
  • 土壤, 藍色 및 其他 織物 染料의 腐蝕山 또는 血液 內 헤모글로빈 과 같은 後續 分析 節次의 抑制劑, 特히 PCR 抑制劑를 包含하는 샘플.
  • 酵母 와 같은 두꺼운 細胞壁을 가진 微生物의 샘플.
  • 여러 出處의 混合 DNA를 包含하는 샘플.

Extrachromosomal DNA는 一般的으로 分離하기 쉽다. 特히 플라스미드 는 細胞 溶解 後 蛋白質 沈澱에 依해 쉽게 分離될 수 있으며, 이는 染色體 DNA를 不溶性 分劃에 가두고 遠心分離 後 플라스미드 DNA를 可溶性 分劃으로부터 精製할 수 있다.

Hirt DNA 抽出은 哺乳動物 細胞에서 모든 染色體 外 DNA를 分離하는 것이다. Hirt 抽出 過程은 高分子量 核 DNA를 除去하고 細胞에 存在하는 저分子量 미토콘드리아 DNA 와 바이러스 에피솜 萬 남긴다.

DNA 檢出 [ 編輯 ]

디페닐아민(DPA) 指示藥은 DNA의 存在를 確認할 것이다. 이 節次는 DNA의 化學的 加水分解를 包含한다. 加熱될 때(예: ≥95°C) 山에서 反應은 데옥시리보스 黨 을 必要로 하므로 DNA에 特異的이다. 이러한 條件에서 2-데옥시리보스는 w-히드록시레不利닐 알데히드로 轉換되고, 이는 化合物인 디페닐아민과 反應하여 靑色 化合物을 生成한다. DNA 濃度는 600에서 溶液의 吸光度 强度를 測定하여 決定할 수 있다. 分光光度計 로 吸光度를 測定하고 알려진 DNA 濃度의 標準 曲線과 比較한다.

260nm 및 280nm 波長에서 DNA 溶液의 吸光度를 測定하는 것은 DNA 純度의 尺度로 使用된다. DNA는 制限 酵素 로 DNA를 切斷하고, 아가로스 겔 에서 이를 實行하고, 브로民畫 에티듐(EtBr) 또는 다른 염색제로 染色하고, DNA의 强度를 알려진 濃度의 DNA 마커와 比較하여 定量할 수 있다.

서던 블롯 技術을 使用하여 이 정량화된 DNA를 分離하고 PCR 및 RFLP 分析을 使用하여 追加로 檢査할 수 있다. 이러한 節次는 게놈 內에서 反復되는 序列의 分化를 許容한다. 法醫學 科學者들이 比較, 識別 및 分析에 使用하는 것은 바로 이러한 技術이다.

高分子量 DNA 抽出法 [ 編輯 ]

이 方法에서 植物 核은 物理的으로 組織을 粉碎하고 固有한 核 分離 緩衝溶液(NIB)에서 損傷되지 않은 核을 再構成하여 分離된다. plastid DNA는 細胞 小器官에서 放出되고 洗滌 및 原審分離에 依해 渗透 緩衝溶液으로 除去된다. 그런 다음 精製된 核을 溶解하고 有機 抽出에 依해 追加로 洗滌하고 genomic DNA를 高濃度 CTAB로 沈澱시킨다. 高純度의 高分子量 gDNA를 核에서 抽出하여 높은 pH 緩衝溶液에 녹여 安定的으로 長期間 保管할 수 있다. [9]

같이 보기 [ 編輯 ]

各州 [ 編輯 ]

  1. ↑ “Discovering DNA: Friedrich Miescher and the early years of nucleic acid research”. 《Human Genetics》 122 (6): 565?81. January 2008. doi : 10.1007/s00439-007-0433-0 . PMID   17901982 .  
  2. ↑ “Evaluation of DNA extraction kits for molecular diagnosis of human Blastocystis subtypes from fecal samples”. 《Parasitology Research》 109 (4): 1045?50. October 2011. doi : 10.1007/s00436-011-2342-3 . PMID   21499752 .  
  3. ↑ 가 나 다 Elkins, Kelly M. (2013). 〈DNA Extraction〉. 《Forensic DNA Biology》 . 39 ?52쪽. doi : 10.1016/B978-0-12-394585-3.00004-3 . ISBN   9780123945853 .  
  4. ↑ 가 나 다 라 Butler, John M (2005). 《Forensic DNA typing : biology, technology, and genetics of STR markers》 2板. Amsterdam: Elsevier Academic Press. ISBN   9780080470610 . OCLC   123448124 .  
  5. ↑ Marmur, J. (1961). “A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms”. 《Journal of Molecular Biology》 3 (2): 208?IN1. doi : 10.1016/S0022-2836(61)80047-8 .  
  6. ↑ “A protocol for extraction and purification of high-quality and quantity bacterial DNA applicable for genome sequencing: A modified version of the Marmur procedure”. 《Protocol Exchange》. 2018. doi : 10.1038/protex.2018.084 .  
  7. ↑ Li, Richard (2015年 3月 11日). 《Forensic biology》 2板. Boca Raton. ISBN   978-1439889725 . OCLC   907517669 .  
  8. ↑ “Ancient DNA: extraction, characterization, molecular cloning, and enzymatic amplification” . 《Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America》 86 (6): 1939?43. March 1989. Bibcode : 1989PNAS...86.1939P . doi : 10.1073/pnas.86.6.1939 . PMC   286820 . PMID   2928314 .  
  9. ↑ Li, Zhigang; Parris, Stephen; Saski, Christopher A. (2020). “A simple plant high-molecular-weight DNA extraction method suitable for single-molecule technologies” . 《Plant Methods》 16 : 38. doi : 10.1186/s13007-020-00579-4 . ISSN   1746-4811 . PMC   7071634 . PMID   32190102 .   Text was copied from this source, which is available under a Creative Commons Attribution 4.0 International License .
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  1. ↑ 가 나 다 選擇 事項
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