酵母蛋白質雜種法 (酵母蛋白質雜種法, 英語 : yeast two-hybrid system 또는 two-hybrid screening , Y2H )은 結合과 같은 物理的인 相互作用을 檢査하여 蛋白質-蛋白質 相互作用 ^[1] 또는 蛋白質-DNA 相互作用 ^{[2] [3]} 을 發見할 때 쓰이는 分子生物學的인 技術이다. 이 檢事의 原理는 上流活性化部位(upstream activating sequence, UAS)에 戰士人者의 結合에 依한 下流報告遺傳子(downstream reporter gene)의 活性이다. Two-hybrid screening을 위해, 戰士인자는 結合도메인(binding domain, BD)과 活性도메인(activating domain, AD)로 불리는 두 조각으로 나뉜다. 結合도메인은 上流活性化部位에 結合하는 도메인이고, 活性도메인은 戰士活性을 하는 도메인이다. ^{[1] [2]}

歷史 [ 編輯 ]

1989年 Stanley Fields와 Song이 開拓한 이 技術은 元來 酵母의 GAL4 戰士活性化를 使用하여 蛋白質-蛋白質 相互作用을 檢出하기 위하여 製作되었다. GAL4蛋白質은 갈落토스 活動에 包含된 蛋白質의 戰死를 活性化한다. ^[4] 그 以後로, 비슷한 原理가 "蛋白質-DNA相互作用", "DNA-DNA相互作用", 그리고 酵母代身 大腸菌 (E. Coli)을 使用하는 것처럼 많은 다른 方法들에 採擇되었다.

基本 前提 [ 編輯 ]

酵母蛋白質雜種法의 核心은 大部分의 진핵 戰士因子들에서 活性도메인과 結合도메인들이 하나의 部品처럼 모듈式이고, 直接的인 結合없이 가까이있을 때 機能을 할 수 있다는 點이다. ^[5] 이것은 비록 戰士因子가 두 조각으로 나뉘어 있더라도, 두 조각이 直接 連結되지 않더라도 戰士가 作動할 수 있다는 것을 意味한다. 大部分의 一般的인 스크리닝의 接近은 酵母蛋白質雜種法이다. ^[6] 이 시스템은 遺傳的으로 技術化되어 아미노산 이나 核酸 의 特定 營養素의 生合成을 할 수 없는 酵母를 活用한다, 營養素가 없는 배지에서 기르게 되면, 酵母는 죽게된다. 이 突然變異 酵母는 플라스미드 의 形態로 外部DNA를 받아들임으로 만들어진다. 酵母蛋白質雜種法에서는 突然變異 酵母에게 미끼와 먹이가 同時에 導入된다.

플라스미드들은 蛋白質 産物을 만들도록 製作된다. DNA結合도메인(BD) 조각은 蛋白質에 붙게하고, 活性도메인(AD) 彫刻은 다른 蛋白質에 붙도록 한다. BD가 붙은 蛋白質은 미끼 蛋白質이 되고, 一般的으로 알고 있는 蛋白質을 使用한다. AD가 붙은 蛋白質은 먹이 蛋白質로 알고 있는 蛋白質, 또는 라이브러리의 알고있거나 모르는 蛋白質을 使用한다. 여기서 라이브러리는 蛋白質-인코딩 序列의 母音으로 特定機關이나 細胞에서 表現되는 모든 蛋白質을 나타낸다. ^[3] 라이브러리를 使用할 때 이 技術은, 各 細胞가 하나 以上의 플라스미드에 感染되지 않는 것을 假定한다.

萬若 미끼와 먹이 蛋白質이 相互作用하면, 戰士人者의 活性도메인과 DNA結合도메인은 間接的으로 連結되고, 活性도메인을 戰士始作地點에 가까이가게하고 報告者遺傳子들의 戰士가 일어날 수 있게 한다. 萬若 두 蛋白質이 相互作用하지 않는 多面, 보고자유전자의 戰士는 일어나지 않는다. 이러한 方式으로, 합쳐진 蛋白質에서 成功的인 相互作用은 細胞의 表現型을 바꾸어 놓는다. ^[1]

固定된 도메인 [ 編輯 ]

硏究에서 蛋白質도메인의 몇몇은 硏究의 目的에 依해 多樣化된다. 反面에 다른 도메인들은 變하지 않는다. 例를 들어, 雜種法硏究에서, DNA結合도메인을 고르기위해 DNA도메인은 다양하게 變化되는 反面, 相互作用하는 두가지 蛋白質인 미끼와 먹이는 반드시 DNA結合도메인과 活性도메인 사이에서 剛한 結合을 維持하기에 變하지 않는다. 蛋白質-蛋白質 相互作用硏究에서, DNA結合도메인은 Zif268科 같이 많은 强한 DNA結合도메인 中에서 골라진다. ^[2] 미끼와 먹이 도메인들 中 자주 골라지는 것은 各各, 酵母 Gal11p의 263-352와 酵母 Gal4의 58-97部分이다. ^[2] 이 도메인들은 酵母-와 박테리아-를 基盤으로 한 選擇 技術에 使用될 수 있고 剛하게 結合된다고 알려진다. ^{[1] [2]}

選擇된 活性도메인은 반드시 細胞自身의 戰士道具들을 使用하여 報告者遺傳子의 戰死를 活性化 시킬 수 있어야 한다. 그래서, 酵母에서 쓰이는 活性도메인들의 多樣性은 박테리아에서는 적합하지 않을 수도 있다. 헤르페스바이러스-誘導 活性도메인인 VP16과 酵母Gal4活性도메인은 成功的으로 酵母에서 使用되고 있다. ^[1] 反面에 E.coli RNA 폴리머라阿弟의 ?-小段位의 部分은 E.coli에 使用된다. ^{[2] [3]}

發現 플라스미드의 製作 [ 編輯 ]

많은 數의 만들어진 油田序列들은 반드시 雜種法 分析을 하기 위해 宿主 細胞로 들어가야 한다. 實驗的인 經驗으로써 油田序列들의 構造와 傳達은 實驗과 有機物에 依해서 달라진다. 雜種 라이브러리에즌 넓게 두 가지 種類가 있다. : 無作爲 라이브러리와 cDNA 를 基盤으로 한 라이브러리. cDNA라이브러리는 특정한 細胞로부터 모아진 mRNA 의 逆轉寫酵素 를 통해 만들어진 cDNA로 構成되어있다. 이 라이브러리는 構造로 될 수 있어서 BD나 AD에 붙을 수 있다. ^[1] 無作爲 라이브러리는 cDNA代身 無作爲 序列의 DNA의 길이를 使用한다. Cassette mutagenesis를 包含한 많은 數의 方法들이 無作爲 序列을 製作하기 위해 存在한다. ^[2] DNA라이브러리의 根源에도 不拘하고 無作爲序列은 適切한 制限酵素를 使用한 플라스미드의 適切한 位置에 들어가게된다. ^[1]

E. coli 에 特化되어 考慮할 事項 [ 編輯 ]

IPTG-誘導可能한 lac 프로모터 아래에 雜種蛋白質을 놓음으로써, 雜種蛋白質은 IPTG가 供給되는 배지에서만 發現될 수 있다. 追後에, 各 遺傳子를 만들 때, 抗體 抵抗性을 달리 發現하는유전자를 넣음으로써, 形質轉換되지 않은 細胞들은 抗體反應에 反應하여 쉽게 걸라 낼 수 있다. ^[2] 보고자 遺傳子는, 처음에는 스스로 박테리아 細胞 게놈에 들어 갈 수 있는 에피솜의 形態로 E.coli 게놈에 揷入된다. ^[2]

蛋白質 情報의 復舊 [ 編輯 ]

選擇이 되면, 蛋白質의 一次構造는 반드시 決定되어야 한다. 이것은 蛋白質-인코딩 序列의 復舊에 依해 進行된다.

E.coli [ 編輯 ]

E. coli 細胞들을 形質轉換시키는데 使用되는 페이지美드는 아마도 選擇된 細胞들로부터 VCS-13도움페이지와 함께 感染에 依해 도움을 받게 된다. 結果的 페이지 彫刻들은 單一가닥의 페이지미드를 가지고 있고 XL-1Blue새砲들을 感染시키는데 使用한다. ^[2] 二重螺旋페이지미드들은 그 以後 이 XL-1Blue 細胞들로 브터 모아진다. 마침내 DNA序列들은 '幕三-길버트 詩퀀싱'을 통해 決定된다.

敏感度 調節 [ 編輯 ]

Escherichia coli -誘導된 Tet-R抑制者는 傳統的인 보고자 遺傳子로 使用될 수 있고 tetracycline 또는 doxicycline(Tet-R抑制者)에 依해 操縱될 수 있다. 그러므로 Tet-R의 發現은 標準雜種界에 依해 操縱된다. 그러나 Tet-R은 앞서 言及하였던 HIS3와 같은 報告者들을 Tet-R프로모터를 통해 發現을 操縱(抑制)한다. Tetracycline은 Tet-R을 使用하여 敏感度를 調節하는데 使用할 수 있다. ^[1]

非融合蛋白質 [ 編輯 ]

非融合蛋白質(non-fusion protein)은 두個의 融合蛋白質과 함께 共同發現한다. 調査에 依하면, 第3의 蛋白質은 融合蛋白質 中 하나의 相互作用을 修正, 媒介, 또는 妨害한다. ^[1]

第3蛋白質의 共同發現은 融合蛋白質의 水晶이나 活性에 必須的이다. 例를 들어 사카로미세스 세레비시아( S. cerevisiae )는 티로신 키나제 를 가지고 있지 않다. 萬若 調査가 티로신 燐酸化를 必要로 한다고 한다면, 키나제는 반드시 티로신 키나제 遺傳子의 形態로 供給되어야 한다. ^[1]

비融合蛋白質은 同時에 融合된 蛋白質들에 붙어서 相互作用을 媒介한다. ^[1]

相互作用하는 相對가 있는 蛋白質에게, 그것의 다른 蛋白質로의 機能的 相同關係는 融合되지 않은 形態의 第3의 蛋白質로 供給된다. 그 뒤, 結合相對로 融合蛋白質과 競爭하거나 하지 않을 수 있다. 第3의 蛋白質과 다른 融合蛋白質의 結合은 보고자 發現 活性 複合體의 形態를 妨害하고, 報告者의 發現을 줄여서, 表現型으로의 變化를 이끈다. ^[1]

나뉜 劉備퀴틴 酵母蛋白質雜種法 [ 編輯 ]

古典的인 酵母蛋白質雜種法의 한가지 限界는 水溶性 蛋白質만 할 수 있는 것이었다. 그러므로, 물에 녹지 않는 幕貫通 蛋白質 사이에서의 蛋白質-蛋白質 反應에서는 酵母蛋白質雜種法을 使用할 수 없었다.나뉜 劉備퀴틴 시스템(split-ubiquitin system)은 이 限界를 克服할 수 있게 해준다. ^[7] 나뉜 劉備퀴틴 시스템에서, 두 幕貫通蛋白質들은 두 個의 다른折半의 劉備퀴틴 에 融合된다: C-末端의 劉備퀴틴("Cub", 殘基 35?76)과 N-末端의 劉備퀴틴("Nub", 殘基 1?34). 融合된 蛋白質들은 미끼와 먹이로 各各 불린다. 幕貫通蛋白質에 融合이 될뿐만아니라, Cub은 또한 戰士人者 에 融合된다. 미끼-먹이 相互作用으로 Nub과 Cub은 組立이 되어서 나뉜 劉備퀴틴을 다시 합친다. 합쳐진 劉備퀴틴은 報告者遺傳子를 자르는 劉備퀴틴 特定 프로테아제에 依해 認識이 되어서 報告者遺傳子를 戰死하게 誘導한다.

日雜種, 三雜種, 그리고 일-이雜種 變種 [ 編輯 ]

日雜種 [ 編輯 ]

日雜種變種(one-hybrid variation)은 蛋白質-DNA 相互作用을 보기 위해서 만들어진 것이고 活性도메인이 直接 結合도메인에 붙은 單一 融合 蛋白質을 使用한다. 그러나 이 境遇에서 結合도메인은 이雜種 蛋白質-蛋白質 分析에서처럼 固定된 序列이 重要하지 않다. 이 라이브러리는 보고자유전자가 만들어지는 프로모터가 있는 目標 序列에 對抗하여 選擇될 수 있다. 陽性選擇 시스템에서, UAS에 成功的으로 結合하고 戰士를 許容하는 結合도메인은 選擇된다. ^[1]

DNA結合도메인의 選擇은 일雜種시스템에서 重要하지 않다는 것을 注目해야한다. 그러나 이雜種시스템에서 結合도메인은 다양하고 미끼와 먹이 蛋白質은 일정함을 維持한다. ^{[2] [3]}

三雜種 [ 編輯 ]

RNA-蛋白質 相互作用은 三雜種變種(three-hybrid variation)을 통해 硏究되고있다. 이 境遇에, 雜種 RNA分子가 두 蛋白質合成 도메인을 結合하는 役割을 한다. ^[1] 비融合蛋白質에 包含된 技術은 같은 機能을 遂行한다.

各州 [ 編輯 ]