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Patch-clamp est un terme anglais designant une technique electrophysiologique d'enregistrement des courants ioniques transitant a travers les membranes cellulaires . Cette technique consiste a mettre en continuite electrique une micro-pipette en verre (diametre de contact de l'ordre de 1 μm) remplie d'une solution ionique de composition definie avec la membrane d'une cellule vivante isolee. Les cellules etudiees peuvent etre des cellules excitables comme les neurones , les fibres musculaires et les cellules beta du pancreas , ou des cellules non excitables, qui presentent elles aussi a leur surface des canaux ioniques. En transferant la sequence genique (transfection) d'un canal ionique d'interet dans une cellule, la technique permet d'etudier le fonctionnement de tout canal ionique . Cette technique permet d'etudier les mecanismes de fonctionnement des canaux ioniques d'une cellule prise individuellement en permettant le suivi en direct des phenomenes d'ouverture, d'inactivation et de fermeture des canaux.

La version moderne de cette technique fut mise au point par Erwin Neher et Bert Sakmann a Gotingen a la fin des annees 1970 et debut des annees 1980, et ce qui leur valut le prix Nobel de physiologie ou medecine en 1991. Ils sont les premiers a avoir ete capables de mesurer l'activite de canaux ioniques individuels, en l'occurrence le canal du recepteur ionotrope de l' acetylcholine .

La technique de patch-clamp peut etre utilisee sous deux modes principaux : en voltage impose ( voltage-clamp ), ce qui permet de mesurer le courant membranaire a un potentiel determine par l'experimentateur, ou en courant impose ( current-clamp ), permettant d'injecter des charges tout en mesurant le potentiel membranaire. La technique est utilisee dans des centaines de laboratoires de recherche, partout a travers le monde.

Le principe de la mesure repose sur l'utilisation de la loi d'Ohm ${\displaystyle U=R\times I}$, ou U est le potentiel (ou la tension), R la resistance et I le courant. Cette loi est plus souvent ecrite ${\displaystyle I=G\times E}$ ou E=U et ${\displaystyle G=1\div R}$ est la conductance. En mode voltage impose, le potentiel est maintenu constant et le courant I est mesure. Les modifications de I dependent directement de G, la grandeur d'interet, puisqu'elle depend directement des proprietes du canal. En mode courant impose, les variations du potentiel de membrane sont mesurees.

Configurations [ modifier | modifier le code ]

Il existe 4 configurations de patch clamp :

• cellule entiere ( whole-cell , en anglais): l'activite macroscopique de l'ensemble des courants cellulaires est mesuree. Les canaux ioniques sont les equivalents electriques de resistances en parallele . La conductance globale G est egale a la somme de chaque conductance unitaire γ multipliee par sa probabilite d'ouverture. Cette technique est utilisee lorsque la conductance unitaire est en dessous du seuil de detection (environ 1 pico Siemens ). Elle est aussi utilisee lorsque les proprietes biophysiques du canal sont trop complexes ou que le type de question pose par l'experimentateur est de l'ordre de la physiologie de la cellule  ;
• cellule attachee (cell attached, en anglais) : la micro-pipette est pressee contre la membrane. Le fragment de membrane sous la pipette n'est pas brise comme dans la configuration cellule entiere, ni la pipette eloignee de la cellule. Cette configuration est utilisee dans les cas ou un facteur inconnu du cytoplasme est necessaire au maintien de l'activite du canal, ou bien lorsque le canal necessite une liaison avec les proteines du cytosquelette . Toutes les autres configurations modifient en effet les milieux baignant les deux faces du canal. Dans celle-ci, le cytoplasme est peu modifie ;
• ≪  outside-out  ≫ (signifiant ≪ externe a l'exterieur ≫), ou le fragment de membrane accole a la pipette de mesure a sa face extracellulaire en contact avec l'exterieur de la pipette. Cette methode est typiquement utilisee pour l'etude de canaux actives par fixation d'un ligand , comme le canal recepteur a l'acetylcholine nicotinique ou les canaux GABA _A . Cette configuration est plus difficile a obtenir que celle ≪ inside-out ≫, ce qui explique que son choix se limite a cette classe de canaux ;
• ≪  inside-out  ≫ (signifiant ≪ interne a l'exterieur ≫), ou le fragment de membrane accole a la pipette de mesure a sa face intracellulaire en contact avec l'exterieur de la pipette. C'est la configuration de choix pour l'etude unitaire de tous les canaux ioniques, sauf ceux dont l'ouverture necessite la fixation d'un ligand (voir ci-dessus). Ces deux dernieres categories permettent de mesurer l'activite d'un seul canal ionique .

Planar patch clamp [ modifier | modifier le code ]

Le planar patch clamp ^{[ 1 ]} est une nouvelle methode developpee pour le criblage electrophysiologique a haut debit. Au lieu de positionner une pipette sur une cellule adherente, les cellules en suspension sont deposees sur une puce (chip) dont la surface comporte une micro-ouverture representant la pipette a surface plane.

Une cellule unique est alors positionnee au niveau de l'ouverture par l'application d'une succion et un contact etroit est forme (Gigaseal). La geometrie d'une surface plane offre une variete d'avantages comparee aux experimentations classiques - il permet d'integrer un systeme de microfluidique qui permet l'application de produits de maniere automatisee pour le criblage des canaux ioniques - le systeme est egalement accessible pour les techniques optiques ou le ≪ scanning probe ≫ et permet egalement une perfusion aussi bien extracellulaire qu'intracellulaire.

Mesure de l'exocytose et de l'endocytose par suivi de capacite membranaire [ modifier | modifier le code ]

Les bicouches lipidiques qui forment l'enveloppe externe cellulaire (membrane plasmique) et celles des organites intracellulaires (vesicules synaptiques, granules de secretion, lysosomes, noyau cellulaire, lymphocytes, REG...) constituent deux faces presentant des charges electriques (≪ tetes ≫ polaires des lipides, hydrophiles) separees par un feuillet isolant (partie hydrophobe des lipides) peuvent etre considerees d'un point de vue biophysique comme des condensateurs, capables d'accumuler des charges ; la capacite electrique (exprimee en farads , unite ayant pour symbole : F) d'une membrane biologique donnee est strictement proportionnelle a sa surface. Il est possible, par les techniques du patch-clamp de mesurer la capacite electrique des objets (totalite de la cellule en configuration ≪ whole-cell ≫ ou cellule entiere, ou bien le fragment de membrane present sous la pipette en ≪ cell-attached ≫ ou ≪ cellule attachee ≫.

Il est ainsi possible de suivre en temps reel, avec des resolutions de l'ordre de la ms, les variations de la capacite membranaire (Cm) liees aux processus d'exocytose (fusion d'organites intracellulaires avec la membrane plasmique) et d'endocytose (internalisation de portions de la membrane plasmique) par suivi des variations de la capacite membranaire ; lors de l'exocytose, la membrane lipidique des organites intracellulaires qui fusionnent avec la membrane plasmique est mise en continuite electrique avec celle-ci : la capacite membranaire mesuree augmente alors, permettant le suivi du processus.

La technique de mesure de l'exocytose ( exoclamping ) par suivi de la capacite membranaire (Cm) a notamment ete menee intensivement dans des cellules neuroendocrines (cellules beta du pancreas ou cellules chromaffines de la medullosurrenale) ou du systeme immunitaire (mastocyte) qui presentent par rapport aux neurones l'avantage de presenter des geometries simples (sensiblement spheriques et de taille reduite), qui favorisent une fixation spatialement homogene de la tension experimentalement appliquee (≪ space-clamp ≫) ; a l'inverse, des cellules aux geometries complexes (ex: certains neurones tres ramifies) ou de grandes dimensions (ex: certaines cellules musculaires) rendent la fixation spatiale de la tension difficile (effet de cable) qui expliquent la difficulte d'y mesurer precisement les variations de Cm. Dans certaines cellules presentant de faibles tailles (~ 10/20 μm) et dont les organites intracellulaires sont de grande taille (plusieurs centaines de nanometres de diametre ; mastocytes, cellules chromaffines par exemple), le suivi de capacite membranaire peut permettre de mesurer des evenements uniques d'exocytose, notamment en configuration ≪ cell-attached ≫.

Notes et references [ modifier | modifier le code ]

Voir aussi [ modifier | modifier le code ]

Articles connexes [ modifier | modifier le code ]

• Biologie cellulaire
• Cellule
• Physiologie

Liens externes [ modifier | modifier le code ]

• (en) Planar patch clamp
• (en) Description du dispositif

• Portail des neurosciences