Staphylococcus aureus
:
Cocos
gram-positivos
A
tecnica de Gram
, mundialmente conhecida como
coloracao de Gram
, e um metodo de coloracao de bacterias desenvolvido pelo medico dinamarques
Hans Christian Joachim Gram
(1853-1938), em
1884
, o qual permite diferenciar bacterias com diferentes estruturas de parede celular a partir das coloracoes que estas adquirem apos tratamento com agentes quimicos especificos. O metodo que consiste em tratar sucessivamente um
esfregaco
bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes
cristal violeta
,
lugol
, etanol-acetona e
fucsina basica
. As bacterias que adquirem a coloracao azul violeta sao chamadas de
gram-positivas
e aquelas que adquirem a coloracao vermelho sao chamadas de
gram-negativas
.
O metodo da coloracao de Gram e baseado na capacidade das paredes celulares de bacterias gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante um tratamento com etanol-acetona enquanto que as paredes celulares de bacterias gram-negativas nao o fazem.
A coloracao de Gram e um dos mais importantes metodos de coloracao utilizados em laboratorios de microbiologia e de analises clinicas, sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterizacao de amostras de bacterias. A tecnica tem importancia clinica uma vez que muitas das bacterias associadas a infeccoes sao prontamente observadas e caracterizadas como gram-positivas ou gram-negativas em esfregacos de pus ou de fluidos organicos. Essa informacao permite ao clinico monitorar a infeccao ate que dados de cultura estejam disponiveis. E possivel a analise de varios esfregacos por lamina, o que facilita a comparacao de especimes clinicos. As laminas podem ser montadas de forma permanente e preservadas como documentacao.
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1
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O metodo consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio solido ou liquido, com um corante primario, o cristal violeta, seguido de tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bacterias gram-positivas quanto gram-negativas absorvem de maneira identica o corante primario e o fixador, adquirindo uma coloracao violeta devido a formacao de um complexo cristal violeta-iodo, insoluvel, em seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente organico, o etanol-acetona (1:1 v:v). O solvente dissolve a porcao lipidica das membranas externas das bacterias gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo e removido, descorando as celulas. Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bacterias gram-positivas e provoca a contracao dos poros do peptidoglicano, tornando-as impermeaveis ao complexo; o corante primario e retido e as celulas permanecem coradas. A etapa da descoloracao e critica, pois a exposicao prolongada ao solvente provoca a remocao do cristal violeta dos dois tipos de bacterias, podendo produzir resultados falsos. A retencao ou nao do corante primario e, portanto, dependente das propriedades fisicas e quimicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura, densidade, porosidade e integridade.
Em seguida, a amostra e tratada com um corante secundario, a fucsina basica. Ao microscopio, as celulas gram-positivas aparecerao coradas em violeta escuro e as gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. Celulas de bacterias gram-positivas, celulas velhas, mortas ou com envelopes danificados por agentes fisicos ou quimicos, tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as celulas coradas como gram-negativas. Portanto, o uso de material fresco e importante. Por outro lado, resultados do tipo "falso gram-positivo" so sao obtidos se o tratamento com etanol-acetona for omitido.
- Confeccionar o esfregaco;
- Corar com cristal de violeta por 60 segundos;
- Lavar com esguicho de agua destilada;
- Cobrir com Iodo de Gram ou Lugol por 60 segundos;
- Lavar com esguicho de agua destilada;
- Descorar com alcool a 95%, ou acetona, 10-20 segundos;
- Lavar com esguicho de agua destilada;
- Corar com fucsina por 20 segundos
- Lavar com agua destilada, secar e observar ao microscopio.
Resultados: Gram (+) coram de roxo, gram (-) cor de rosa
Pseudomonas aeruginosa
:
Bacilos
gram-negativos
As caracteristicas estruturais da parede bacteriana estao na base da tecnica de Gram que funciona da seguinte forma.
O primeiro
corante
(cristal-de-metila) penetra na
bacteria
assim como o
mordente
(Soluto de Lugol). Intracelularmente forma-se um complexo corante-
iodo
, insoluvel em agua, que vai corar o
protoplasma
e a
parede celular
. A camada de peptidoglicano e maior em bacterias gram positivas, as gram negativas, por sua vez possuem pouco peptidoglicano e sao coradas pelo vermelho de safranina.
A lavagem com alcool 99,5º GL dissolve o complexo corante-iodo, e a se a parede celular for permeavel a este, arrasta-o para fora da celula. As bacterias capazes de preservar a coloracao roxa do 1º corante, o violeta de Genciana, designam-se por Gram positivas. As bacterias que, apos a lavagem com alcool-acetona, sao incapazes de reter o violeta de Genciana, designam-se por Gram negativas, corando pela fucsina diluida que se fixa apenas nas bacterias gram-negativas. Resumindo, as bacterias Gram positivas coram de roxo e as Gram negativas coram de vermelho. Esta tecnica de coloracao permite entao a distincao entre bacterias com parede celular mais ou menos rica em peptidoglicanos. De referir que embora uma bacteria Gram negativa nunca possa corar positivamente pelo Gram, uma bacteria estruturalmente Gram positiva pode corar negativamente se a sua parede de peptidoglicano for destruida ou danificada (ex. envelhecimento celular ou accao de
lisozimas
).
Na observacao microscopica pos coloracao o material a observar deve ser previamente
fixado
, o que facilita a observacao de bacterias, uma vez que tem reduzidas dimensoes, fraco contraste e algumas
refringencia
e mobilidade.
A fixacao e a
coagulacao
do
protoplasma
bacteriano com o minimo de deformacao e sua colagem a
lamina
. Como exemplos de agentes fixadores temos o calor, o
formol
e o
eter
.
A coloracao recorre do uso de corantes e permite aumentar o contraste e evidenciar a estrutura bacteriana. Estes sao compostos organicos, com um ou mais aneis
benzenicos
que se encontram ligados a dois grupos funcionais, o
cromoforo
que e responsavel pela cor do corante e o auxocromo que se dissocia ionicamente em solucao dotando o corante de capacidade para reagir com os tecidos, celulas e estruturas celulares. Podemos diferenciar dois tipos de corantes: os corantes acidos (sao negativos, formando sais com cations) e os corantes basicos (sao positivos, formando sais com anions). Como as bacterias possuem carga electrica negativa, existe afinidade entre os corantes basicos e as estruturas celulares da bacteria, permitindo que esta fique corada. Para reforcar a acao do corante, aumentando a forca de ligacao deste, as estruturas celulares utilizam-se de mordentes como o
acido tanico
, o
acido cromico
, o
acido fenico
, o
iodo
(Soluto de
Lugol
), o calor e os alcalis. Os solutos corantes sao compostos de varias substancias, sendo geralmente hidro-alcoolicos-fenicados porque, alem da substancia corante, possuem agua para permitir a dissociacao ionica do corante; alcool para conservar e acido fenico, que atua como mordente e como bacteriostatico, evitando a contaminacao das solucoes corantes. Apos a aplicacao do corante, aplica-se um diferenciador, que serve para retirar o excesso de corante (
acetona
,
acido sulfurico
,
alcool
95º). Os diferenciadores tem a capacidade de descorar certas bacterias ja previamente coradas e sao usados em coloracoes policromaticas.
A preparacao de coloracoes policromaticas segue um protocolo constante. Assim, sobre um esfregaco (celulas fixadas pelo calor), aplica-se:
- O primeiro corante
- O
mordente
- O
diferenciador
- Agua (vai parar a diferenciacao)
- Segundo corante (vai ser contrastante)
Referencias