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ハイスル?プットスクリ?ニング

出典: フリ?百科事典『ウィキペディア（Wikipedia）』
ハイスル?プットスクリ?ニングロボット

ハイスル?プットスクリ?ニング ( 英語 : high-throughput screening 、 HTS ) は、特に 創? で使用される、生物?及び化?の分野に?連する科???の方法である。ロボット工?、デ?タ?理及び制御ソフトウェア、液?ハンドリングデバイス、及び敏感な?出器を用いて、ハイスル?プットスクリ?ニング（HTS）は、?究者が遺??的、化?的、?理?的な何百万もの試?を迅速に?施することを可能にする。このプロセスを通じて、短時間のうちに特定の生?分子?路を調節する、活性化合物、 抗? 、あるいは 遺?子 を同定することができる。これらの??の結果は、?をつくるためのはじめの段階となり、生物?の?究のはじめの段階となる。

アッセイプレ?トの調製 [ 編集 ]

ロボットのア?ムがアッセイプレ?トを操作している。

HTSの鍵となる??器具（容器）は、 マイクロタイタ?プレ?ト である。マイクロタイタ?プレ?トとは、ウェルと呼ばれる小さな穴(試?管に相?する)がたくさんあり、つかむグリッドがある、通常は使い捨てのプラスチックで作られた容器のことである。 2013年頃の一般的なHTSのためのマイクロプレ?トは、384、1536、または3456ウェルである。これらは8×12のウェルが9ミリメ?トルの間隔を置いた「96ウェルマイクロプレ?ト」が??より使われていた影響で、すべてが96の倍?になっている。ウェルのほとんどには??に使われる物質が入れられる。ウェルにはすべて同じ化合物の水溶液が入れられる場合もあるし、すべてのウェルにそれぞれ異なる化合物の水溶液が入れられる場合もある。また、ある種の細胞または酵素をそれぞれのウェルに入れることもできる。（いくつかのウェルは空であるか、??のコントロ?ルとして使用することを意?して、未?理のサンプルを含んでいたりもする。）

スクリ?ニングの施設は普通、注意深く集められた 化合物ライブラリ? が入った「ストックプレ?ト」を保持している。ライブラリ?とは、いろいろな種類の化合物などのひとそろいのことであり、その??室で作製したり、または販?されているものを購入したりする。「ストックプレ?ト」自身は直接??に使用されず、必要に?じて代わりに別の「アッセイプレ?ト」が作成される。「アッセイプレ?ト」は元は完全に空のプレ?トであり、??するウェルに「ストックプレ?ト」のウェルから少量の液?（多くの場合、ナノリットルで測定される）をピペットにより注入されて作成される。つまり、?に「アッセイプレ?ト」は「ストックプレ?ト」のコピ?である。

反?の測定 [ 編集 ]

?究者は、??の準備のために、タンパク質、細胞、あるいは動物の胚などでプレ?トの各ウェルを?たす。それらの生物?的な物質と、ウェル中の化合物とが、吸?、特異的に結合、または反?（または反?しない）するための時間が?過した後、手動または機械によって、全てのウェルが測定される。?究者自身が測定するのはコンピュ?タでは簡?に判?できない場合であり、例えば、ウェルの化合物に起因する胚?生の?化や欠?、?微鏡を使用した?化、?果を調べたいときにしばしば必要である。それ以外の場合は、?門の自動分析機が、ウェル上に多?の??を一度に測定する。タンパク質がどの程度結合したかなどの指標とすることができるように設計し、それらの上に偏光を照射し、反射率を測定するなどで測定できるようにしておくことでこのような自動化が可能になる。この場合、機械は、?一のウェルから得られた測定値と、ウェルの各番?を結果として出力する。大容量の分析機は非常に迅速に、小さなスペ?スに入れられた?十のプレ?トを測定することで、?千の??を?行することができる。

自動化システム [ 編集 ]

円形のスライド式の?納設備が、アッセイプレ?トを保管し、高い?容能力と高い取り出し速度に貢?している。

オ?トメ?ションつまり自動化は、HTSの有用性における重要な要素である。典型的には、1つ以上のロボットからなる統合されたロボットシステムは、アッセイプレ?トを移動させたり、サンプルおよび試?を添加、混合、インキュベ?ションをしたりして、最終的に?出のための場所に動かすことをする。HTSシステムは、普通、同時に多くのプレ?トを、準備、インキュベ?ト、分析、デ?タを?集するため、これらのプロセスを高速化することができる。一日10万の化合物のテストができるHTSロボットが、現在、存在している。 [1] 自動コロニ?ピッカ?は、ハイスル?プット遺?子スクリ?ニングのために、微生物のコロニ?を?千もピックアップできる。 [2] uHTSという用語があり、（超ハイスル?プットスクリ?ニングultra-high-throughput screeningの略）、は一日10万以上の化合物のスクリ?ニングが可能なものを指す（2008年頃）。

??計?とデ?タ分析 [ 編集 ]

多種の化合物（例えば、小分子または siRNA のような）の迅速なスクリ?ニングの能力により、HTSは近年、??結果のデ?タ量の急?につながっている。 [3] ?って、HTS??の最も基本的な課題であるのだが、大量に出てくるデ?タから生化?的意義を見出せるかどうかは、適切な??デザインと、品質管理と「ヒット」の選?のための分析方法の開?と採用に依存している。 [4] HTSの?究は、Proteomics, Inc.の最高科?責任者である、John Blumeが次のように表現する性質をもった?究になっている。つまり「科?者が、いくつかの統計?や基本的なデ?タハンドリング技術を理解していない場合は、本?の分子生物?者とは考えられず、?に「恐?」となる。(Soon, if a scientist does not understand some statistics or rudimentary data-handling technologies, he or she may not be considered to be a true molecular biologist and, thus, will simply become "a dinosaur.")」 [5]

品質管理 [ 編集 ]

高品質のHTSアッセイは、HTS??で重要である。高品質のHTSアッセイの開?は、??と計算のアプロ?チの?方の統合による品質管理（QC）が必要。QCの三つの重要な手段は、（i）良好なプレ?ト設計、（ii）結果の違いの程度を測定するための?果的な品質管理の測定基準の開?であり、それらによって、劣った品質のデ?タを同定することができる。 [6] 良いプレ?トのデザインは、系統誤差（特にウェルの配置が?わる）を識別しやすくし、「ヒット」の選?と品質管理のために、どのような正規化をして、系統誤差の影響を取り除くあるいは減らすかを、判?するのに役立つ。 [4]

?果的な、分析的な品質管理の方法は、優れた品質のアッセイのために重要な役割を果たす。典型的なHTS??では、ポジティブコントロ?ルおよびネガティブコントロ?ルを、明確に設定できているかが、良い品質の指標となる。提案されている、品質を評?する尺度の多くは、ポジティブコントロ?ルおよびネガティブコントロ?ルの設定の程度を測定する。シグナル-バックグラウンド比、シグナル-ノイズ比、signal window、assay variability ratio、およびZ-factorは、デ?タの品質を評?するために使われる。 [4] [7] ?密に標準化された平均差（SSMD）は、最近、HTSアッセイにおいてデ?タ品質を評?するために提案されている。 [8] [9]

「ヒット」の選? [ 編集 ]

HTSにおいて、?果の見?みが大きい化合物は「ヒット」といわれている。「ヒット」を選?するプロセスが、hit selection（「ヒット」の選?）といわれている。繰り返しがある場合と繰り返しがないスクリ?ニングでの、「ヒット」の選?のための分析方法は異なりる。繰り返しがないスクリ?ニングは通常は初めのスクリ?ニングで、繰り返しのあるスクリ?ニングは通常は確認のためのスクリ?ニングである。例えば、z-score method（ Zスコア法 ）は反復のないスクリ?ニングに適し、 t?定 は反復のあるスクリ?ニングに適している。反復のないスクリ?ニングのための、SSMDの計算も、反復があるものとは異なる。 [4]

繰り返しのない一次スクリ?ニングでの「ヒット」の選?のために、容易に解?できる違いは、average fold change（平均倍率?化）、mean difference（平均差）、percent inhibition（阻害パ?セント）、およびpercent activity（活性％）である。しかし、それらは?果的にデ?タの違いを捕捉しない。すべての化合物は、スクリ?ニング?のネガティブコントロ?ルと同じ値を持っているという?定に基づいてデ?タの?動をとらえるのが、z-score method（Zスコア法）またはSSMDである。 [10] [11] しかし、そのようなZスコアのような方法は、外れ値に敏感であり、HTS??では外れ値は一般的であり、問題となる可能性がある。結果として、z*-score method, SSMD*, B-score methodや、quantile-based methodのような?固な方法が提案され、「ヒット」の選?のために採用されている。 [4] [12] [13]

繰り返しのあるスクリ?ニングでは、直接、各化合物の?動を推定することができる。結果として、我?は、z-scoreやz*-scoreが依存する?い?定（?注：おそらく、前段落のネガコンと同じ値をもっているという?定）に依存しないSSMDまたはt?定を使用する必要がある。t?定とp値を用いるひとつの問題は、それらはサンプルサイズおよびeffect sizeによって影響されることである。 [14] それらは平均差の?定はできても、化合物の?果の大きさを測定するためには設計されていない。「ヒット」の選?のための、大きな?心事は、試?した化合物の?果の大きさである。SSMDは直接影響の大きさを評?する。 [15] SSMDは、他の一般的な?果の大きさよりも良好であるかが示される。 [16] SSMDのpopulation valueはいくつもの??を通しての比較を可能にし、化合物の?果の大きさを測定するために、SSMDのpopulation valueに?して同じカットオフを使用することができる。 [17]

スル?プットの向上と?率のための技術 [ 編集 ]

1つまたは複?のプレ?トにわたる化合物の配置をうまくすることで、プレ?トあたりのアッセイ?を?加させたり、またはアッセイの結果のばらつきを抑えたりできる。この技法は、簡素化された?定のもとに成り立っていて、それは、同じウェル?の任意のN個の化合物は、互いに、またはアッセイの標的と相互作用せず、?の「ヒット」を?出するアッセイの能力に影響しないということである。

例えば、次のプレ?トを想像してみる。化合物Aをウェル1-2-3、化合物Bをウェル2-3-4、化合物Cをウェル3-4-5に入れるとする。このプレ?トを、タ?ゲットに?して行うアッセイをして、ウェル2、3、4で「ヒット」があったとすると、それは、化合物Bが、最も可能性の高い??であることを示す。このアプロ?チを用いるのであれば、どの2つの化合物も複?のウェルを共有しないようにし、化合物のペアどうしの干?の可能性を減らす。

最近の進? [ 編集 ]

2010年3月には、スクリ?ニングを??の千倍速くできるように（10時間で億の反?）??した?究が?表された。??技術より（10のマイナス７?倍の試?量しか使用せず、コストを100万分の1にした。 [18] オイルによって分離された流?の滴は、マイクロプレ?トウェルに入り、分析を可能にし、試?がチャネルを通って流れている間に「ヒット」を?別する。

2010年に、?一のカメラで同時に64個の異なる出力チャネルの?光測定を可能にするために、マイクロ流?アレイ上に配置することができるレンズのシリコンシ?トが開?された。 [19] このプロセスは、１秒で20万滴を分析することができる。

?統的なHTS創?は、精製されたタンパク質または無傷の細胞を使用してきたが、最近開?された非常に興味深い技術は、センチュウ（Caenorhabditis elegans）とゼブラフィッシュ（ゼブラフィッシュ）のように、無傷の生物を使用する。 [20]

生物?の?術的な?究のためのHTSの利用の?加 [ 編集 ]

HTSは、比較的最近の技術革新で、主にロボット工?や高速コンピュ?タ技術の近代的な進?を通じて可能になった。HTSの??を?行するには、?門性の高い、高?なスクリ?ニング?究室が必要である。多くの場合、小、中程度のサイズの?究機?は自分で施設をもつのではなく、?存のHTS施設のサ?ビスを利用する。この傾向は、創?を?術的に?究する大?でみられる。 [21] 通常は、産業界にのみ見られるこれらの施設は、現在では、大?でもみられるようになってきた。 例えば、UCLAは、日常的に10万以上の化合物を１日にスクリ?ニングすることができる分子スクリ?ニング共有リソ?ス（Molecular Screening Shared Resources　MSSR、UCLA）のオ?プンアクセスのHTS?究室を備えている。オ?プンアクセスのポリシ?は、世界中から?究者が長い知的財産交?なしに、この機能を利用することができるようになることである。MSSRがもつ20万を超える小分子の化合物ライブラリ?は、アメリカ西海岸のすべての大?の中で最大である。MSSRは（ゲノムワイドsiRNA、shRNA、cDNAおよびCRISPR）などの小分子を備え、遺?子の機能を調べるゲノムワイドスクリ?ニングを?行するためにHTSの機能を活用できる。ハイスル?プットの小分子スクリ?ニングとゲノムワイドスクリ?ニングを?方使用することで、疾患または小分子に?する標的の同定および??が可能になる。

?一のsiRNAまたはcDNAを含有する、「?べられた」機能的 ゲノムライブラリ? （"arrayed" functional genomics libraries）を使用することによって正確な結果を得ることができる。機能ゲノム?は、典型的には、 ハイコンテントスクリ?ニング と?になっている。ハイコンテントスクリ?ニングは 落射?光?微鏡法 や、レ?ザ?走査サイトメトリ?を使用する。ミネソタ大?と同?にイリノイ大?はまた、HTSのための施設をもつ。ミシガン大?の生命科??究所は、ケミカルゲノミクスセンタ?にHTS施設を?設している。ロックフェラ?大?には、165,000を超える化合物のライブラリ?を備えるオ?プンアクセスのHTSリソ?スセンタ?HTSRC（ロックフェラ?大?、HTSRC）がある。ノ?スウェスタン大?のハイスル?プット分析?究所は、標的同定、バリデ?ション、アッセイ開?、および化合物スクリ?ニングをサポ?トしている。非?利Sanford Burnham Prebys Medical Discovery InstituteはまたHTS施設をもつ（ the Conrad Prebys Center for Chemical Genomics の一部）。米?のNational Institutes of Health（NIH）は、生物?的?究で使用するための革新的な化?ツ?ルを製造するための小分子スクリ?ニングセンタ?の全?コンソ?シアムをつくった。

脚注 [ 編集 ]

[ 脚注の使い方 ]
  1. ^ Hann MM, Oprea TI (June 2004).
  2. ^ Development of a screening platform for directed evolution using the reef coral fluorescent protein ZsGreen as a solubility reporter
  3. ^ Howe D, Costanzo M, Fey P, Gojobori T, Hannick L, Hide W, Hill DP, Kania R, Schaeffer M, Pierre SS, Twigger S, White O, Rhee SY (2008).
  4. ^ a b c d e Zhang XHD (2011).
  5. ^ Eisenstein M (2006).
  6. ^ Zhang XH, Espeseth AS, Johnson EN, Chin J, Gates A, Mitnaul LJ, Marine SD, Tian J, Stec EM, Kunapuli P, Holder DJ, Heyse JF, Strulocivi B, Ferrer M (2008).
  7. ^ Zhang JH, Chung TD, Oldenburg KR (1999).
  8. ^ Zhang, XHD (2007).
  9. ^ Zhang XHD (2008).
  10. ^ Zhang XHD (2007).
  11. ^ Zhang XH, Ferrer M, Espeseth AS, Marine SD, Stec EM, Crackower MA, Holder DJ, Heyse JF, Strulovici B (2007).
  12. ^ Zhang XH, Yang XC, Chung N, Gates A, Stec E, Kunapuli P, Holder DJ, Ferrer M, Espeseth AS (2006).
  13. ^ Brideau C, Gunter G, Pikounis B, Liaw A (2003).
  14. ^ Cohen J (1994).
  15. ^ Zhang XHD (2009).
  16. ^ Zhang XHD (2010).
  17. ^ Zhang XHD (2010).
  18. ^ Agrestia JJ, Antipovc E, Abatea AR, Ahna K, Rowata AC, Barete JC, Marquezf M, Klibanovc AM, Griffiths AD, Weitz DA (2010).
  19. ^ "High-throughput fluorescence detection using an integrated zone-plate array" .
  20. ^ Atanasov AG, Waltenberger B, Pferschy-Wenzig EM, Linder T, Wawrosch C, Uhrin P, Temml V, Wang L, Schwaiger S, Heiss EH, Rollinger JM, Schuster D, Breuss JM, Bochkov V, Mihovilovic MD, Kopp B, Bauer R, Dirsch VM, Stuppner H (2015).
  21. ^ High-throughput screening goes to school

?考文? [ 編集 ]

  • Staff (2008-08-01). Staff (2008年8月1日). “High-Throughput Screening Challenges” . Genetic Engineering & Biotechnology News (Mary Ann Liebert) 28 (14): pp. 26–27. ISSN   1935-472X . http://www.genengnews.com/articles/chitem.aspx?aid=2571 2008年10月1日 ??。   Staff (2008年8月1日). “High-Throughput Screening Challenges” . Genetic Engineering & Biotechnology News (Mary Ann Liebert) 28 (14): pp. 26–27. ISSN   1935-472X . http://www.genengnews.com/articles/chitem.aspx?aid=2571 2008年10月1日 ??。  
  • Zhang XHD (2011) "Optimal High-Throughput Screening: Practical Experimental Design and Data Analysis for Genome-scale RNAi Research, Cambridge University Press"
  • Florian, Amy; Lepensky, C; Kwon, O; Sklar, L; Haynes, M (201). "Flow cytometry enbles a high-throughput homogenous fluorecent antibody-binding assay for cytotoxic T cell lytic granule exocytosis". Journal of Biomolecular Screening. 4 (18): 420?429. doi:10.1177/1087057112466697. Flow cytometry enables a high-throughput homogeneous fluorescent antibody-binding assay for cytotoxic T cell lytic granule exocytosis AE Florian, CK Lepensky, O Kwon… - Journal of …, 2012 - jbx.sagepub.com http://jbx.sagepub.com/content/early/2012/11/14/1087057112466697.abstract

?連項目 [ 編集 ]

外部リンク [ 編集 ]

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