Os
cromosomas artificiais humanos
(
CAH
ou mais conecidos polas siglas inglesas
HAC
) son vectores de transferencia para grandes fragmentos de ADN. Estan en desenvolvemento desde a decada de 1990, tras o exito dos cromosomas artificiais de
levedo
YAC
e, mais recentemente, de bacterias
BAC
e os
PAC
derivados do plasmido P1. Os
YAC
e
PAC
utilizanse para clonar grandes
loci
genomicos incluidas as rexios reguladoras, e tenense utilizado moito para xerar mapas fisicos do
xenoma
humano, identificar xenes de enfermidades por clonacion posicional, e para xerar ratos
transxenicos
para estudos de
expresion xenica
.
Funcions dos cromosomas artificiais humanos
[
editar
|
editar a fonte
]
Representacion da transferencia mediada por microcelulas dun cromosoma humano a unha celula de rato.
Os
HAC
son vectores de transferencia de xenes que se comportan e se construen como os
cromosomas
humanos normais. Poden replicarse, segregan de maneira estable e usan os componentes funcionais da celula humana, evitando asi os problemas de integracion no xenoma do
hospede
; por tanto, poden introducirse noutras celulas humanas sen problema. Son moi utiles para estudar a expresion e entender a funcion dos cromosomas, xa que ofrecen a posibilidade de expresar grandes fragmentos de ADN humano noutros modelos animais.
A combinacion de fragmentos de cromosomas ou os cromosomas artificiais humanos por transferencia mediada por microcelulas facilitou o mapeo de xenes humanos e diversos estudos xeneticos. A recente aparicion da enxenaria de tecidos nai baseada en celulas abriu novas vias para as
terapias xenicas
e celulares. Agora a tarefa en marcha e o desenvolvemento de vectores seguros e eficaces que poidan introducir xenes terapeuticos en celulas troncais ou nais e manter a expresion reguladora especifica a longo prazo destes xenes. Ainda que segue sendo necesario mellorar a eficiencia da transferencia, os HACs posuen varias caracteristicas que se requiren para un bo vector de terapia xenica, incluido o seu mantemento
episomal
estable na celula e a capacidade de insercion de xenes de gran tamano. Ademais, os
HACs
tamen poden conter loci xenomicos con elementos reguladores, que permiten a expresion de transxenes nun ambiente xenetico semellante ao do cromosoma natural.
Construcion dos cromosomas artificiais humanos
[
editar
|
editar a fonte
]
A hora de crear os
HAC
, o traballo centrase na determinacion dos requisitos para a sua formacion. O mais importante na definicion das secuencias dos HAC, e a funcion do
centromero
e a identificacion funcional do
cinetocoro
. O principal elemento funcional do centromero humano definiuse como α satelite ou ADN alfoide .
[
1
]
Tamen se determinou o tamano minimo da matriz alfoide compatible cun centromero funcional.
Os HAC son minicromosomas exoxenos creados artificialmente. A maioria xeranse seguindo dous enfoques diferentes, xa sexa "un enfoque de arriba cara a abaixo" (enxenaria de cromosomas, fragmentacion dun cromosoma natural), ou "un enfoque de abaixo cara a arriba" (creacion
de novo
do cromosoma artificial).
Fragmentacion dun cromosoma natural
[
editar
|
editar a fonte
]
Representacion da creacion dun cromosoma artificial humano por fragmentacion dun cromosoma natural.
O primeiro enfoque, desenvolvido en 1991, foi a fragmentacion de cromosomas asociados a
telomeros
(
TACF
) ou telomeros
TDT
. Esta tecnica implica a fragmentacion sucesiva dun cromosoma humano especifico de acollida en pequenos minicromosomas, utilizando un vector de orientacion que abrangue un segmento terminal dos
telomeros
, un marcador xenetico, e, as veces unha rexion de homoloxia co cromosoma obxectivo. Os minicromosomas resultantes segregan de forma autonoma normalmente. Este metodo tivo exito na fragmentacion dos cromosomas humanos
X
e
Y
. Con este enfoque tamen se indicou que son necesarias un minimo de 100
kb
de ADN alfoide para a estabilidade en cromosomas humanos.
Os
HACs
tamen poden construirse por medio de tecnicas de fragmentacion dos telomeros dun cromosoma en linas celulares de
polo
hiper-recombinoxenicas, DT40, ainda que a eficiencia e similar a dos
HACs
de creacion
de novo
, existen problemas que necesitan resolverse. Con este enfoque podense xerar mini-cromosomas linais estables, que varian en tamano desde 0,5 ata 10 Mb. Estes mini-cromosomas mantenen un
centromero
normal e estable durante a
mitose
nas celulas humanas so con reordenamentos menores. Poren, estes
HACs
requiren un sitio de clonacion para inserir xenes exoxenos.
Para construir este tipo de vectores, un contido substancial do brazo
[
2
]
p
ou
q
dun cromosoma humano vai diminuindose a traves de duas roldas de truncamento telomerico en dito cromosoma. Despois, unha secuencia
loxP
unica (unha secuencia diana para a
recombinacion homologa
da
recombinase
Cre
) cun xene
neo
sen o
promotor
introducese no brazo
q
. Por tanto, polo menos en teoria, calquera ADN circular (
BAC
, PAC, ou YAC
circular) cun sitio
loxP
e un promotor pode restaurar a
expresion xenica
mediada por
neo-Cre
por medio da insercion no sitio
loxP
especifico do
HAC
. Esta tecnica experimentouse no
cromosoma 21
humano, creando un vector
HAC
de 4,5
Mb
de tamano, con tres caracteristicas utiles para ser un bo vector xenico:
- Unha arquitectura xenetica ben definida.
- E independente dos cromosomas de acollida.
- A sua
mitose
e estable nas
celulas somaticas
e nas celulas de
rato
.
No sitio
loxP
podense introducir unha ou varias copias dun xene de interese.
Estratexia para incorporar xenes en cromosomas artificiais humanos.
Consiste en xerar cromosomas artificiais por medio da introducion de clonado centromerico e telomerico en celulas humanas en
cultivo
.
O proposito inicial de xerar
HAC de novo
e mellorar a comprension dos requisitos da estrutura do
cromosoma
e a sua funcion, en particular o papel do
centromero
. O centromero e unha complexa estrutura cromosomica que ten unha funcion mecanica no cromosoma, xa que serve como un sitio para a montaxe da separacion dos cromosomas mediada polos
microtubulos
do
cinetocoro
durante a
division celular
.
A montaxe
de novo
do
HAC
foi desenvolvida en 1997 por Willard e o seu grupo de traballo. En celulas de fibrosarcoma humanas
HT1080
introduciuse unha combinacion de ADN humano sintetico α-satelite, ADN humano telomerico xerado pola
reaccion en cadea da polimerase
(PCR), e ADN xenomico humano ao chou para montar un cromosoma artificial humano linal exoxeno. Posteriormente, outros grupos tamen informaron da xeracion exitosa de HACs de novo utilizando celulas HT1080, conseguindo o precursor da transfeccion de ADN humano α-satelite e os telomeros clonados de forma linal en
YAC
s, ou de forma circular en
cromosomas artificiais bacterianos
(BAC) ou fagos P1 (
PAC
).
Na maioria dos casos, os
HAC
s xerados
de novo
son circulares, cun tamano entre 1 e 10 Mb, e demostrouse que son mitoticamente estables. Tamen se desenvolveron outros sistemas para crear rapidamente cromosomas artificiais humanos baseados en cromosomas artificiais bacterianos utilizando un sistema de recombinacion do virus bacteriofago λ, ou usando un
transposon
Tn5 bacteriano modificado. A utilizacion invasiva do sistema de
Escherichia coli
tamen pode facilitar a formacion de cromosomas artificiais humanos
de novo
.
Hai varios factores que limitan a aplicacion dos
HACs
creados
de novo
como vectores de xenes.
- En primeiro lugar, o problema mais critico e a sua estrutura e a relacion impredicible entre o ADN de entrada e o
HAC
resultante, especialmente en termos do seu tamano e composicion. Estes
HACs
varian en tamano, desde 1 ata 10 Mb, o que suxire que as reorganizacions e amplificacions do complexo se producen durante o proceso de formacion de mini-cromosomas.
- En segundo lugar, o ADN de entrada poderia integrarse no xenoma do hospede.
- En terceiro lugar, a formacion de
HACs
tivo exito en limitadas linas celulares humanas, como as celulas de
fibrosarcoma
HT1080.
Usos dos cromosomas artificiais humanos
[
editar
|
editar a fonte
]
Un dos usos principais dos cromosomas artificiais humanos pola sua potencialidade como vectores de
expresion xenetica
son os tratamentos de
terapia xenica
. A analise da expresion espacial e temporal axeitada do HAC en ratos transxenicos indica a capacidade destes vectores para o seu uso en terapia xenica somatica.
Uso de
HACs
como vectores de transferencia
[
editar
|
editar a fonte
]
Unha solucion as cuestions xurdidas do uso de sistemas de vectores virais disponibles na actualidade e o uso de cromosomas artificiais humanos (HAC), porque se replican e segregan independentemente no xenoma do hospede como cromosomas naturais.
Os HACs poden imitar fielmente o patron normal da expresion xenica, xa que poden conter loci xenomicos completos, incluindo
elementos de regulacion
"
corrente arriba
" e "
corrente abaixo
". Ademais, por mor da sua existencia episomal (insirense en distintas partes do xenoma), moitas complicacions, tales como o
silenciamiento de xenes
terapeuticos ou
oncoxenese
derivadas da integracion en sitios desfavorables, poden reducirse ao minimo.
Tenen un uso potencial para tratar enfermidades producidas por deficiencias xenicas, como a
diabetes
insulino-dependente, creando HACs que leven o transxene da proinsulina e fagan que a celula do humano adulto poida xerar a sua propia
insulina
.
Poden usarse para manter a correccion a longo prazo dos xenes defectuosos debido a que estes vectores son estables durante moitas divisions celulares, polo menos nas celulas humanas.
Tamen poden complementar os
fenotipos
mutantes e recuperar
knockouts
de xenes en modelos de rato (
rato knockout
).
- Basu, J., y H. F. Willard. (s.d.). Cromosomas artificiales humanos: posibles aplicaciones y consideraciones clinicas.
https://web.archive.org/web/20070712022755/http://purl.org/dc/dcmitype/Text
, . Recuperado Marzo 24, 2010, a partir de
http://dialnet.unirioja.es/servlet/articulo?codigo=2352139
.
- Harrington, J. J., G. V. Bokkelen, R. W. Mays, K. Gustashaw, y H. F. Willard. 1997. Formation of de novo centromeres and construction of first-generation human artificial microchromosomes. Nat Genet 15:345-355. doi: 10.1038/ng0497-345.
- Hoshiya, H., Y. Kazuki, S. Abe, M. Takiguchi, N. Kajitani, Y. Watanabe, T. Yoshino, Y. Shirayoshi, K. Higaki, G. Messina, G. Cossu, y M. Oshimura. 2008. A highly Stable and Nonintegrated Human Artificial Chromosome (HAC) Containing the 2.4 Mb Entire Human Dystrophin Gene. Mol Ther 17:309-317. Recuperado Marzo 24, 2010, a partir de
http://dx.doi.org/10.1038/mt.2008.253
.
- Ikeno, M., H. [. Inagaki, K. Nagata, M. Morita, H. [. Ichinose, y T. Okazaki. 2002. Generation of human artificial chromosomes expressing naturally controlled guanosine triphosphate cyclohydrolase I gene. Genes to Cells 7:1021-1032. doi: 10.1046/j.1365-2443.2002.00580.x.
- Katoh, M., F. Ayabe, S. Norikane, T. Okada, H. Masumoto, S. Horike, Y. Shirayoshi, y M. Oshimura. 2004. Construction of a novel human artificial chromosome vector for gene delivery. Biochemical and Biophysical Research Communications 321:280-290. doi: doi: DOI: 10.1016/j.bbrc.2004.06.145.
- Kawahara, M., T. Inoue, X. Ren, T. Sogo, H. Yamada, M. Katoh, H. Ueda, M. Oshimura, y T. Nagamune. 2007. Antigen-mediated growth control of hybridoma cells via a human artificial chromosome. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects 1770:206-212. doi: doi: DOI: 10.1016/j.bbagen.2006.10.014.
- Kotzamanis, G., W. Cheung, H. Abdulrazzak, S. Perez-Luz, S. Howe, H. Cooke, y C. Huxley. 2005. Construction of human artificial chromosome vectors by recombineering. Gene 351:29-38. doi: doi: DOI: 10.1016/j.gene.2005.01.017.
- Larin, Z., y J. E. Mej?a. 2002. Advances in human artificial chromosome technology. Trends in Genetics 18:313-319. doi: doi: DOI: 10.1016/S0168-9525(02)02679-3.
- Oshimura, M., y M. Katoh. (s.d.).
Transfer of human artificial chromosome vectors into stem cells
.
- Otsuki, A., C. G. Tahimic, N. Tomimatsu, M. Katoh, D. J. Chen, A. Kurimasa, y M. Oshimura. 2005. Construction of a novel expression system on a human artificial chromosome. Biochemical and Biophysical Research Communications 329:1018-1025. doi: doi: DOI: 10.1016/j.bbrc.2005.02.079.
- Suda, T., M. Katoh, M. Hiratsuka, M. Takiguchi, Y. Kazuki, T. Inoue, y M. Oshimura. 2006. Heat-regulated production and secretion of insulin from a human artificial chromosome vector. Biochemical and Biophysical Research Communications 340:1053-1061. doi: doi: DOI: 10.1016/j.bbrc.2005.12.106.
- Tsuduki, T., M. Nakano, N. Yasuoka, S. Yamazaki, T. Okada, Y. Okamoto, y H. Masumoto. 2006. An Artificially Constructed De Novo Human Chromosome Behaves Almost Identically to Its Natural Counterpart during Metaphase and Anaphase in Living Cells. Mol. Cell. Biol. 26:7682-7695. doi: 10.1128/MCB.00355-06.