ELISA ( acronimo del ingles Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay: ‘ensayo por inmunoadsorcion ligado a enzimas’) es una tecnica de inmunoensayo en la cual se detecta un antigeno inmovilizado mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable, como un cambio de color o algun otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, existe un anticuerpo primario que reconoce al antigeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima antes mencionada. La aparicion de colorantes permite medir indirectamente, mediante espectrofotometria , el antigeno en la muestra.

Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular esta presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran numero de variables, tales como seleccion de reactivo, temperatura, medicion de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente, puede afectar los pasos sucesivos y el resultado de la prueba.

La tecnica ELISA fue propuesta como una alternativa al radioinmunoensayo, ya que este ultimo suponia un riesgo para la salud debido a los isotopos radiactivos utilizados.

Esta tecnica se diferencia de otras basadas en la reaccion Ag-Ac en que la union a una superficie solida permite la identificacion de reacciones especificas y, por lo tanto, la obtencion de resultados cuantitativos.

Usos [ editar ]

La interaccion antigeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infeccion o una enfermedad autoinmune. Pero como prueba diagnostica, posee diversas limitaciones que conviene conocer:

• En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa necesariamente que el paciente este enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado enferma y que ya se ha recuperado puede seguir produciendo anticuerpos. Esto originaria un falso positivo .
• En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que estos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo . Seria el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren en el periodo ventana de la infeccion en el momento de realizar la prueba, o que esten infectadas por una cepa extrana.
• En tercer lugar, pueden aparecer falsos negativos cuando se da inespecificidad entre antigeno-anticuerpo.

En estos casos de diagnostico de enfermedad, es recomendable la eliminacion (mediante centrifugacion) de celulas de la sangre que puedan interferir con el ensayo y puedan ocasionar un resultado falso positivo, careciendo aquel de especificidad. Tambien, debemos tener en cuenta que cuando se trata de diagnosticar una enfermedad que posee un valor predictivo positivo bajo en una determinada poblacion ?es decir, que esa enfermedad tiene muy baja incidencia en dicha poblacion?, es necesario volver a confirmar el resultado positivo mediante otro metodo de diagnostico independiente. Normalmente, se lleva a cabo un western blot donde se detecta la presencia de varios anticuerpos, simultaneamente, frente a la misma infeccion en una muestra. El resultado del western se considera positivo cuando aparecen al menos 5 bandas, que indica que 5 anticuerpos diferentes estan presentes en el sujeto frente a esa infeccion. Es entonces cuando se diagnostica como positivo a dicho paciente.

Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versatil, robusto y simple en su realizacion, mediante el uso de la fase solida, una separacion facil entre la fraccion retenida y la fraccion libre.

Ademas se han propuesto y desarrollado diferentes metodos de amplificacion de la senal (luminiscentes, cascadas enzimaticas...) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos ELISA a la obtenida en el RIA ( radioinmunoensayo ) hormonal.

Este metodo ha tenido una enorme aplicacion en todos aquellos campos en los que se precisaba la cuantificacion de productos mediante anticuerpos: diagnostico clinico, deteccion viral, clasificacion de anticuerpos en isotipos, busqueda de anticuerpos monoclonales , etc.

Dispositivos empleados en ELISA [ editar ]

Se han ensayado numerosas fases solidas, desde los tubos de cristal de los origenes hasta las actuales microplacas de 96 pocillos de plastico tratado, para aumentar su capacidad de adsorcion (en su superficie) de moleculas, y con fondos de pocillo opticamente claros que permitan realizar las medidas de densidad optica en instrumentos especificos, espectrofotometros de lectura de placas que han recibido el nombre de lectores ELISA . Actualmente se estan desarrollando dispositivos de mayor capacidad ?por ejemplo, con 384 y 1536 pocillos?, adecuados para los sistemas de screening masivo de los sistemas robotizados (HTS, High-throughput system ).

Los lectores ELISA son espectrofotometros capaces de realizar lecturas seriadas de cada uno de los pocillos de la placa ELISA. A diferencia de un espectrofotometro convencional, con capacidad de leer todas las longitudes de onda del ultravioleta y el visible de manera continua, los lectores de ELISA disponen de sistemas de filtros que solo permiten la lectura de una o pocas longitudes de onda; son la que se corresponden con las necesarias para determinar la densidad optica de los cromogenos mas comunmente utilizados.

Fases de un ensayo ELISA [ editar ]

1. Union del antigeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La union de anticuerpos o antigenos se realiza con facilidad a la superficie de plasticos tratados que tienen gran afinidad por proteinas. Asi, el procedimiento de recubrimiento de los pocillos debe realizarse cuidadosamente. Si se usa mucho antigeno, se pueden obtener falsos positivos. Por el contrario, si se usa poco antigeno, esto dara lugar a una reaccion falsa negativa.
2. Conjugacion del anticuerpo o del antigeno con una enzima ( peroxidasa , fosfatasa alcalina ...). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc. El antigeno marcado se emplea en ensayos de competicion de antigeno. Dicha union anticuerpo-enzima o antigeno-enzima ha de producirse durante un determinado periodo de tiempo en aras de producir una solucion coloreada y que pueda ser valorada visualmente o cuantificada por medio de un espectrofotometro (normalmente a una longitud de onda de 414 nm). Si no transcurre el tiempo adecuado para que se de la reaccion, no se evidenciara ningun color, interpretandose este resultado como un falso negativo y disminuyendo la sensibilidad de la tecnica.
3. Revelado de la reaccion enzimatica. Despues de un lavado para eliminar todas las moleculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos, se anade el sustrato enzimatico, se incuba durante un tiempo estandarizado por cada casa comercial, en el cual se producira una reaccion enzimatica, luego se frena esta reaccion mediante el uso de una solucion stop y se lee la densidad optica mediante espectrofotometria.
4. Formacion de una o mas capas de inmunocomplejos. En el caso del antigeno unido a la placa, se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antigeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antigeno y un secundario anti-primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo metodo permite la amplificacion de la senal al poderse unir uno o mas anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa, se incuba con una mezcla de antigeno y antigeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antigeno frio frente a una cantidad fija de antigeno marcado. Es el ensayo de competicion del antigeno. En esta etapa es muy importante controlar los factores tiempo y temperatura de incubacion para evitar la aparicion de falsos negativos. En el caso del tiempo, si es inferior a 15 minutos, no ocurrira la interaccion antigeno-anticuerpo y el color no sera evidente al final del ensayo, dando un falso negativo. Por su parte, si la temperatura de incubacion es muy baja, la formacion del complejo antigeno-anticuerpo tampoco se completara en el tiempo establecido, mientras que si es muy alta, las proteinas (antigeno y anticuerpo) se desnaturalizan y, por tanto, disminuyen su capacidad para interaccionar, dando igualmente falsos negativos.

Tipos de ensayos ELISA [ editar ]

Se han desarrollado multiples variantes de ensayos ELISA que permiten la cuantificacion de un antigeno en solucion, la deteccion de un anticuerpo en una solucion (por ejemplo en el clonaje de anticuerpos monoclonales) o la determinacion de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo. A continuacion se describen los mas comunes. ^{[ 1 ]} ​

• ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antigeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antigeno en la solucion analizada. Es necesario incluir controles negativos que seran muestras del mismo tipo que las analizadas (sangre, orina...), pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antigeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antigeno buscado). ^{[ 2 ]} ​
• ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de la misma forma a la anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de deteccion emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antigeno y uno secundario marcado contra el primario. La deteccion tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificacion de senal debida a la union de dos o mas anticuerpos secundarios por cada primario. Es el ensayo mas popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimatico permiten cuantificar una gran variedad de antigenos; por eso es un metodo mas polivalente y barato, aunque se pierda algo de precision por tener un eslabon mas con respecto al metodo directo. La dilucion de la solucion que contiene el anticuerpo primario ?por ejemplo, suero sanguineo? es un factor muy importante a tener en cuenta para evitar la aparicion de falsos negativos, ya que si la muestra esta muy diluida, no saldra positiva si la titulacion de anticuerpos es muy baja. (Es decir, aunque los anticuerpos estan presentes, la prueba no da positivo porque la concentracion de anticuerpos especificos contra el antigeno que esta pegado en el fondo del pocillo no es suficiente como para dar una senal detectable.).

El ELISA indirecto es el metodo de eleccion para detectar la presencia de anticuerpos sericos contra el virus de la inmunodeficiencia humana ( VIH ), agente causante del sindrome de inmunodeficiencia adquirida ( SIDA ). Segun esta tecnica, proteinas recombinantes de la envoltura y el nucleo del VIH se adsorben como antigenos en fase solida a los pocillos. Las personas afectadas de VIH producen anticuerpos sericos contra epitopos en estas proteinas viricas. En general, el ELISA indirecto permite detectar anticuepos sericos contra VIH desde las primeras seis semanas de una infeccion. ^{[ 3 ]} ​

• ELISA inhibidor o competitivo: Este tipo de ELISA es el mas complejo. Se utiliza para detectar o cuantificar antigenos presentes en bajas cantidades. Se denomina asi ya que se utiliza un antigeno de referencia que competira con el antigeno de la muestra por la union al anticuerpo. El procedimiento simplificado seria el siguiente:

1. El antigeno de referencia se inmoviliza sobre la placa.
2. Por otro lado, un exceso de anticuerpo primario sin marcar se incuba con la muestra que contiene el antigeno de interes, dando lugar a la formacion de complejos antigeno-anticuerpo
3. Se anade la mezcla antigeno-anticuerpo a la placa, donde el antigeno de referencia competira con el antigeno de la muestra por unirse al anticuerpo
4. Se lava la placa eliminando los complejos antigeno-anticuerpo solubles
5. Se anade a la placa un anticuerpo secundario marcado con una enzima que se unira al anticuerpo primario anclado al antigeno de referencia.
6. Se anade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionara una senal visible.

• ELISA ≪sandwich≫ (Ensayo de captura de antigeno y deteccion mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antigeno. Despues de lavar el exceso de anticuerpo, se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antigeno, que sera retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Despues de un segundo lavado que elimina el material no retenido, se aplica una solucion con un segundo anticuerpo anti-antigeno marcado. Asi, pues, cada molecula de antigeno estara unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificacion de senal que permite el segundo anticuerpo.
• ELISPot . ELISpot es un metodo altamente sensible en la inmunologia para enumerar las celulas que producen una citoquina dada. Las celulas se estimularon en una placa de microtitulacion per-recubierta con un anticuerpo especifico anti-analito. En respuesta a la estimulacion, las celulas liberan citocinas que se unen al anticuerpo anti-analito. Despues de una etapa de lavado, que elimina las celulas de los pozos, la ubicacion de citoquinas secretadas se visualiza mediante un anticuerpo de deteccion marcado con enzima y su sustrato cromogenico correspondiente. El resultado final es un conjunto de manchas de color, cada uno de los cuales representa un area donde se habia localizado una celula que secreta la citoquina. Existe un metodo de ELISpot estandar y una variacion denominada de celulas dendriticas DC-ELISpot para la deteccion de las celulas tras la estimulacion con oligopeptidos y antigenos de proteina, respectivamente.

Utilidades diagnosticas [ editar ]

Cancer : identificacion de biomarcadores para su diagnostico en etapas tempranas

Hepatitis B :

• Deteccion del antigeno de superficie del VHB (agHBS
• Deteccion de anticuerpos contra el antigeno del core del VHB (agHBS). Estos pueden ser IgG, que persisten durante toda la vida, o IgM, que solo duran 6 meses, por lo que indican hepatitis B aguda.

Deteccion de anticuerpos antiplaquetarios para el diagnostico de enfermedades como la purpura trombocitopenica inmune (PTI) o el lupus sistemico eritematoso. ^{[ 4 ]} ​

Deteccion de VIH mediante la determinacion simultanea de anticuerpos anti- VIH y antigeno p24. ^{[ 5 ]} ​

Quimioluminiscencia [ editar ]

Durante determinadas reacciones quimicas, la luz generada por este fenomeno constituye una alternativa conveniente y muy sensible para las mediciones de absorbancia en ELISA. Los tipos de ELISA que recurren a la quimioluminiscencia utilizan un sustrato que genera luz, en lugar del sustrato cromogeno de las reacciones ELISA ordinarias. Tales son los casos de la oxidacion del compuesto luminol por peroxido de hidrogeno y la enzima peroxidasa de rabano (HRP), que producen luz. La luz que se genera en dichas reacciones puede detectarse gracias a su capacidad de sensibilizar una pelicula fotografica. La medicion cuantitativa de la emision de luz puede hacerse mediante el uso de un luminometro.

La ventaja de las pruebas de quimioluminiscencia sobre las cromogenas es la mejoria de la sensibilidad. En general, el limite de deteccion puede aumentarse al menos diez veces si se cambia un sustrato cromogeno por uno que emita luz, y mas de doscientas veces cuando se adicionan agentes potenciadores.

Marcadores enzimaticos mas comunmente utilizados [ editar ]

En la tabla siguiente se recogen los marcadores enzimaticos mas comunmente empleados en ensayos ELISA, los sustratos que se emplean para su revelado y el modo de prepararlos.

Enzima sustrato tampon

• HRP (peroxidasa de rabano) OPD 10 mg/25 mL de tampon citrato sodico 0,15 M pH  5; anadir microL de 30 % peroxido de hidrogeno 30 %.
• TMB 2,5 mg/250 microL de DMSO; hasta 25 ml con tampon citrato sodico 0,1 M pH 6; anadir 5 microL de peroxido de hidrogeno 30 %.
• ABTS 60 mg/100 mL de tampon citrato sodico 0,1 M pH 6; anadir 35 microL de peroxido de hidrogeno 30 %; parar con fluoruro sodico 1,25 %; leer a 405 nm.
• DAB 10 mg/20 mL de tampon Tris 50 mM pH 7,4; filtrar y anadir 20 microL de peroxido de hidrogeno 1 %.
• CNP 6 mg en 1 mL de metanol; anadir 10 mL de tampon Tris 50 mM pH 7,4; filtrar y anadir 40 microL de peroxido de hidrogeno 30 %.
• AEC 80 mg en 1 mL de N,N'-dimetilformamida + 200 microL de tampon acetato 0,1 M pH 4,5; filtrar y anadir 50 microL de peroxido de hidrogeno 30 %.
• ASA 80 mg/100 mL de agua destilada caliente; ajustar a pH 6,0 con 1 mM NaOH y anadir 10 % por volumen de 0,05 % peroxido de hidrogeno; parar con 25 microL de NaOH 1 M.
• AP ( fosfatasa alcalina ) PNPP 5 mg/5 mL de tampon dietanolamina-HCl 0,1 M pH 9,8 + 1 mM cloruro de magnesio.
• NAPFB ( A ) 4 mg de fosfato de naftol en 200 microL de dimetilformamida en un tubo de vidrio ( B ) 10 mg de sal Fast Blue BB/10 ml de tampon Tris 0,05 M pH 9,2 - 2 mM cloruro de magnesio. Mezclar A + B y filtrar.
• NAPR ( A ) 4 mg de fosfato de naftol en 200 microL de dimetilformamida en un tubo de vidrio ( B ) 10 mg de sal Red BB/ 10 ml de tampon Tris 0,05M pH 9,2 - 2 mM cloruro de magnesio. Mezclar A + B y filtrar.
• BCIP 1 mg/mL en solucion AMP (2-amino-2-metil-propanol).
• beta-G ONPG 2,5 mg/ml en tampon fosfato sodico 0,1 M pH 7,0 + 1 mM cloruro de magnesio + 0,1 M beta-mercaptoetanol .
• ureasa BP 8 mg/1,48 ml de 0,01 M NaOH; llevarlo a 100 ml con agua desionizada; anadir 100 mg de urea y EDTA a 0,2 mM; ajustar el pH a 4,8 con 1 mM NaOH o HCl; almacenar a 4 °C.
• PG IS Anadir a cada placa de ELISA 25 microL de cada uno de los reactivos siguientes en secuencia: ( A ) 1 % (peso/vol) gelatina en 0,1 M tampon fosfato pH 7,0; ( B ) 1 % (peso/vol) almidon en agua destilada caliente; ( C ) 3,04 mg/mL de benzil-penicilina en 0,1 M tampon fosfato pH 7,0 (5000 U/mL); ( D ) 0,01 N ioduro en 0,1 M KI solucion stock (en una botella oscura).

Prueba ELISPOT [ editar ]

Una variante de la prueba ELISA, llamada ELISPOT es capaz de detectar cuantitativamente el numero de celulas en una poblacion productora de anticuerpos especificos contra un antigeno determinado o un antigeno contra el que se dispone de un anticuerpo especifico. Aqui, dichas placas se recubren con el antigeno reconocido por el anticuerpo de interes o con el anticuerpo especifico para el antigeno cuya produccion se valora. Seguidamente, se anade a las placas recubiertas una suspension de la poblacion celular que se investiga e incuba. Las celulas se disponen en la superficie de la placa, y las moleculas secretadas reactivas a las moleculas de captura son unidas en la cercania de las celulas secretoras, produciendose un anillo de complejos antigeno-anticuerpo alrededor de cada celula que sintetiza la molecula de interes. Despues, la placa se lava y un anticuerpo unido a enzima especifico para el antigeno secretado, o para la especie de anticuerpo secretado, se anade y deja que se unan. El posterior revelado del ensayo mediante adicion de un sustrato cromogeno o emisor de luz adecuado indica la posicion de cada celula productora de anticuerpo (o de antigeno) como un punto de color o luz. ^{[ 6 ]} ​

Referencias [ editar ]