Placa de Petri
amb
agar MacConkey
solid i un
inocul
en estria de
Proteus vulgaris
.
Un
cultiu
es un metode per a la multiplicacio de
microorganismes
, com ara
bacteris
,
fongs
o
virus
, en el qual es prepara un
medi de cultiu
per afavorir el proces desitjat. El cultiu es emprat com un metode fonamental per a l'estudi dels microorganismes que causen malalties en
medicina
humana i
veterinaria
. El cultiu de microorganismes es tambe fonamental en l'elaboracio de certs aliments com la
cervesa
, el
pa
, el
iogurt
o el
vinagre
.
Molts microorganismes son susceptibles de poder esser cultivats pel que els metodes de cultiu microbia son usats per a determinar la presencia d'un determinat microorganisme en una mostra. Tanmateix hi ha microorganismes que no poden ser cultivats si mes no en un
cultiu pur
, format per una sola
especie
o
clon
, ja que solen requerir la presencia d'altres especies amb les que estableixen relacions
ecologiques
estretes. Per a solucionar aquesta dificultat s'ha optat per a determinar la presencia d'aquests microorganismes enutjosos mitjancant tecniques de deteccio molecular basats en la deteccio de proteines especifiques (p. ex.:
immunofluorescencia
,
transferencia Western
…) o d'
ADN
(p. ex.:
reaccio en cadena de la polimerasa
,
transferencia d'RNA
,
hibridacio in situ per fluorescencia
).
Exemples de sembra en estria sobre una
placa de petri
.
Sembra escocesa
(esquerra) i
sembra per estria simple
(dreta). A baix es representa al creixement de les colonies mitjancant color taronja. Al principi de l'estria el creixement de les colonies es confluent i no permet un aillament. Al final de l'estria el cultiu ha generat colonies aillades arrodonides.
Per a determinar la presencia d'un determinat microorganisme en una mostra es fan servir cultius en que una part d'aquesta mostra s'inocula en un
medi de cultiu
. Aquest proces s'anomena sembra, de forma analoga a la
sembra
agricola. Aixi doncs, la
sembra
o inoculacio es un pas clau de qualsevol metode de cultiu. En un medi liquid la inoculacio sol efectuar-se afegint un petit volum amb la mostra. En el cultiu solid la sembra pot ser per estria mitjancant una nansa microbiologica que s'inocula amb la mostra i es frega lleugerament sobre la superficie del medi de cultiu sovint disposat a l'interior d'una
placa de Petri
fent una o diverses estries. En aquestes estries sobre l'agar solidificat queden adherides les cel·lules que despres del cultiu hauran generat les colonies sobre aquestes estries.
Representacio esquematica d'un metode de sembra per dilucio. A cada pas de dilucio el nombre de colonies obtingudes es redueix.
Un altre metode de sembra es la
sembra per dilucio
on la mostra es diluida en un medi isotonic, usualment solucio de
Ringer
, on es transfereixen els microorganismes presents a la mostra a la "solucio mare". A partir d'aquesta solucio mare es fan
dilucions
decimals de les que se n'extreu un volum precis que sera abocat en una placa de cultiu. Aquest volum es repartit per tota la superficie del medi de cultiu mitjancant una ansa de sembra especial anomenada nansa de
Digralsky
similar a una
espatula
. La sembra per dilucio permet estimar la concentracio d'organismes en la mostra original.
Diversos models de nanses de Digralsky amb diferents materials
Medis de cultiu
[
modifica
]
En funcio dels requeriments de cada microorganisme es triara un o altre medi de cultiu. Cada medi de cultiu es una mescla en diferents proporcions de nutrients. En funcio de l'estat del medi es poden classificar en
medis solids
o
liquids
. Els medis liquids tenen la propietat que permeten la seva barreja i un millor intercanvi de gasos (oxigen, dioxid de carboni...). Els medis solids, al contrari que els liquids no ho permeten amb tanta facilitat, pero son escollits preferentment per a fer l'
aillament
dels microorganismes que hi han de proliferar, ja que les
colonies
usualment queden fixades en un punt concret del medi. Generalment el cultiu solid es degut a la
gelificacio
d'un medi liquid mitjancant
agar
.
Un microorganisme es pot sembrar en un medi liquid o en la superficie d'un medi solid d'
agar
. Els medis de cultiu contenen diferents
nutrients
que van, des de
sucres
simples fins substancies complexes com la
sang
o l'extracte de brou de carn. En general tots els medis han de disposar de fonts de
materia
(
carboni
,
nitrogen
,
fosfor
…) i
energia
en forma de
compostos quimics
que el microorganisme pugui assimilar pel seu propi metabolisme. Els medis de cultiu determinen el
pH
que pot determinar la velocitat de proliferacio i inclus inhibir-la. Sovint s'afegeixen substancies per inhibir el creixement de microorganismes no desitjats als medis, com ara
antibiotics
o
antifungics
.
Per aillar o purificar una especie bacteriana a partir d'una mostra formada per molts tipus de microorganismes, se sembra en un medi de cultiu solid on les
cel·lules
que es multipliquen no canvien de localitzacio; despres de molts cicles reproductius, cada bacteri individual genera per
fissio binaria
una colonia macroscopica composta per desenes de milions de cel·lules similars a l'original. Si aquesta colonia individual se sembra al seu torn en un nou medi creixera com a cultiu pur d'un sol tipus de bacteri.
Condicions de cultiu
[
modifica
]
Tipus de proliferacio de microbis segons la seva relacio amb l'oxigen:
1.
Aerobics
obligats,
2.
Anaerobics
obligats,
3.
Anaerobics facultatius
4.
Microaerofils
5.
Aerotolerants.
Gerra de cultiu anaerobic. Aquest es un dels tipus mes facils d'aconseguir. Les plaques de petri un cop sembrades es disposen dins del pot i s'hi introdueix una
espelma
encesa. Tot seguit es tanca hermeticament el pot i la
flama
de l'espelma consumeix bona part de l'oxigen.
En funcio de la fisiologia de l'organisme que es vol fer
proliferar
cada medi ha de dur uns o altres
nutrients
. A mes cada microorganisme pot tenir unes determinades tolerancies a la presencia d'
oxigen
cosa que pot requerir una o altre tipus de cultiu. En general per a organismes que toleren be la presencia d'
oxigen
(aerobics, anaerobics facultatius i aerotolerants) no s'utilitzen metodes per evitar la seva exposicio a aquest element present a l'atmosfera. Tanmateix els anaerobics solen requerir el seu cultiu dins de dispositius en que s'exclou la presencia d'oxigen. Hi ha per exemple les gerres d'anaerobics que consumeixen l'oxigen, be sigui amb una flama o be introduint un gas inert (generalment nitrogen) que desplaci el gas de l'atmosfera, o be afegint substancies que consumeixin l'oxigen (p. ex.
sulfit
). Altres metodes de cultiu per a anaerobics poden ser el cultiu en
placa de Petri
amb cobertura d'
agar
o el
cultiu en dilucio de tub
on la mostra es embeguda en agar liquid usualment dins d'un
tub d'assaig
, un cop es refreda l'agar aquest se solidifica.
Un cop inoculat en un medi de cultiu cal incubar la mostra a una
temperatura
adequada per afavorir la multiplicacio optima. La majoria de microorganismes patogens solen requerir temperatures optimes al voltant de 37 °C (mesofils), pero altres poden requerir temperatures baixes (psicrofils) o altres temperatures elevades (termofils). Per aconseguir aquestes temperatures constants es fan servir estufes
Corba tipica de creixement de les poblacions microbianes en cultius tancats.
Els cultius microbians emprats en
microbiologia clinica
solen ser
cultius tancats
, pero en casos d'investigacio o de microbiologia aplicada se solen fer
cultius en continu
. El cultiu tancat parteix d'una quantitat limitada de nutrients i segueix unes fases tipiques en funcio de l'estat fisiologic dels microorganismes. Quan s'inocula un cultiu els microorganismes de l'
inocul
solen estar en una fase de repos o baix nivell metabolic. Aixi doncs, la primera fase o fase de latencia que pot arribar a durar des d'alguns minuts fins a hores segons l'especie durant la qual els microorganismes es "desperten" de la seva inactivitat reactivant internament el seu metabolisme. En aquesta fase practicament no hi ha divisio cel·lular i la quantitat de microorganismes per unitat de
volum
(
ufc
/ml) practicament no varia al llarg del temps. En un determinat moment s'entra a la fase exponencial on els microorganismes estan plenament activats i utilitzen massivament els nutrients del medi per a multiplicar-se. En aquesta segona fase el nombre de microorganismes per unitat de volum augmenta de forma
exponencial
al llarg del temps fins a esgotar els nutrients moment en que s'entra en la tercera fase o fase estacionaria o d'altipla (per la forma que adquireix el grafic). En aquesta fase la quantitat de microorganismes viables per unitat de volum es maxima i roman estable durant un cert temps i els microorganismes tornen a un estat de latencia fisiologica, deturant la seva multiplicacio. Gradualment els microorganismes deixen de ser viables (no poden tornar a dividir-se) entrant en la darrera etapa del cultiu o fase de declivi.
Els
cultius oberts
o
continus
son una solucio elegant per a mantenir un cultiu microbia en alguna d'aquestes fases del cultiu tancat. Al contrari que aquest ultim el cultiu obert te una entrada i una sortida de volum liquid, de manera que el volum del contenidor on hi ha el cultiu, anomenat sovint
bioreactor
o fermentador, es mante constant. Aixi doncs el cultiu obert sempre es fa en medi liquid. L'addicio d'un
flux
constant de nou medi de cultiu permet que hi hagi nous nutrients a la seva disposicio. Tanmateix la sortida de volum tambe representa una perdua de microorganismes viables pel que la velocitat del cabal que es pot aplicar abans de "rentar" el cultiu es directament proporcional a la velocitat a la que es pot dividir el microorganisme en les condicions de cultiu donades. Aixi doncs cabals alts faran que el cultiu estigui en fase exponencial mentre que velocitats baixes poden fer que el cultiu es trobi en fases estacionaries. Els cultius continus es fan servir per a l'obtencio industrial d'algun dels metabolits de rebuig (p. ex. produccio de
vinagre
o
antibiotics
), o altres productes (obtencio d'
insulina
) o per la utilitzacio de l'activitat microbiana (p. ex.: per al
tractament d'aigues residuals
).
Bibliografia
[
modifica
]
- Madigan
, Michael T.;
Martinko
, John M.;
Parker
, Jack. ≪Capitulo 5. Crecimiento microbiano≫. A: Isabel Capella.
Brock. Biologia de los Microorganismos
(en castella). 8a ed.. Espanya:
Prentice Hall
, 1998, pags 149-177.
ISBN 84-89660-36-0
.
Enllacos externs
[
modifica
]